甲贝课堂 | mRNA之Poly（A）尾长度及分布测定
技术背景
真核生物中，几乎每条mRNA的尾部都会带有多聚腺苷酸，即Poly(A)，它是在转录的同时添加到mRNA上的，是成熟mRNA由细胞核外运至胞浆必需的（图1）。哺乳动物的Poly(A)尾平均长度约为200nt，其在酵母中平均约70nt[2-5]。
早期基于实验证据的假说认为，Poly(A)尾与胞浆中的多聚腺苷结合蛋白（PABPC）促进翻译并阻止mRNA降解（decay），但具体机制并不清楚。
最近对Poly(A)尾的作用认识更加丰富Poly(A)结合蛋白可以促进Poly(A)的去除（即发生脱腺苷化，deadenylation），而当mRNA稳定且高频翻译时，Poly(A)在稳态下的长度远低于预期。此外，翻译延伸的速率会影响脱腺苷化。因此，Poly(A)尾、PABPC、翻译过程和mRNA降解间的相互作用在基因调控中起重要作用。
图1 mRNA poly(A)尾在胞浆中调控基因表达的功能概览[1]
值得一提的是，Poly(A)尾的动态对基因表达的调控至关重要，几乎在真核生物的各个生命过程中均起重要作用，这包括在发育早期、炎性反应和突触可塑性中。对应于基因调控中的保守、关键作用，许多关键转录本要么带有Poly(A)尾，要么使用一个等效替代物行使Poly(A)尾功能。例如在后生动物（metazoans）中，依赖复制过程的组蛋白mRNA的Poly(A)尾就被一种独特的3’核糖核蛋白（RNP）复合体所替代[6-7]。
mRNA的转录后调节（含Poly(A)尾长度的调节）是基因表达最精确的调控方式，决定蛋白质组的组成。随着测序技术、生化重建、结构生物学的进步，使得研究者对Poly(A)尾生物学的认识提高到一个崭新的分子层面。目前已确认，Poly(A)尾长度并非如之前设想的那样恒定不变，Poly(A)尾中也可以含有非A的核苷酸组分，Poly(A)尾长度、翻译效率和mRNA稳定性之间并不是简单的线性关系。
检测原理
RNase T1 是一种核糖核酸内切酶，它特异地作用于鸟嘌呤核苷酸3'端磷酸并切割与相邻核苷酸相连的磷酸二酯键。反应的终产物为鸟嘌呤核苷3'磷酸及末端带鸟嘌呤核苷3'磷酸的寡核苷酸（见图2）。
图2 RNase T1酶的酶切机理
mRNA 的Poly(A)尾巴5’端的序列为鸟嘌呤核苷酸，因此可以利用RNase T1酶将mRNA序列中的Poly(A)片段进行酶切。随后利用Dynabeads™Oligo(dT)25磁珠进行Poly(A)片段的富集，如图3所示。
图3 PolyA酶解产物的富集纯化机理
分析流程
图4 工作流程
数据处理流程
送样要求
1) mRNA样品：>250 μg（浓度≥0.5mg/ml）；
2) 样品形式：液体、干粉；
3) 保存方式：低温（干冰）
参考文献
Passmore, L. A., & Coller, J. (2022). Roles of mRNA poly(A) tails in regulation of eukaryotic gene expression. Nature reviews. Molecular cell biology, 23(2), 93–106. https://doi.org/10.1038/s41580-021-00417-y
J. Biol. Chem. 235, 1142–1149 (1960).
Nat. New Biol. 233, 41–43 (1971).
Proc. Natl Acad. Sci. USA 68, 1336–1340 (1971).
J. Biol. Chem. 248, 1466–1471 (1973).
Genes Dev. 5, 2108–2116 (1991).
Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 337–344 (2008).
Mol. Cell. Biol. 28, 1182–1194 (2008)
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